Otimizacao das condicoes para a aquisicao de dados de derivados e para a determinacao das fases dos fatores de estrutura de cristais de proteinas por meio da difracao da luz sincrotron
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Instituto de Física "Gleb Wataghin"
UNICAMP

Otimizacao das condicoes para a aquisicao de dados de derivados e para a determinacao das fases dos fatores de estrutura de cristais de proteinas por meio da difracao da luz sincrotron

Tese de Doutorado de : Nagem, Ronaldo Alves Pinto
Orientada por: Polikarpov Igor
Publicada em 2003

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Resumo

Resumo

    Atualmente, os modelos tridimensionais de macromoléculas biológicas obtidos por meio das técnicas de difração de raios-X (cristalografia) ou de ressonância magnética nuclear constituem uma das bases principais para o desenho racional de fármacos. Nesse contexto, a área de cristalografia de proteínas é responsável por cerca de 85% de todos os modelos estruturais de macromoléculas biológicas encontrados nos bancos de dados. Este fato, por si só, tem permitido um grande avanço da área tanto em instituições de pesquisa científica quanto em empresas farmacêuticas. Desde que a linha de luz CPr do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS, Campinas, SP, Brasil) foi construída e aberta à comunidade científica em 1997, centenas de conjuntos de dados de difração de raios-X por cristais de macromoléculas biológicas têm sido coletados. Grande parte desses conjuntos foi usada para resolver a estrutura de proteínas pela técnica de substituição molecular; técnica esta que utiliza um modelo tridimensional já conhecido semelhante àquele que se pretende determinar. Contudo, até 1999, quando o projeto desta tese foi escrito, não mais do que duas estruturas cristalográficas inéditas haviam sido resolvidas por grupos de pesquisa no Brasil. Em vista disso, o projeto teve como objetivo principal otimizar as condições necessárias para a resolução de estruturas inéditas de proteínas usando as facilidades da linha CPr do LNLS. O processo envolveu não só a preparação das amostras para a coleta de dados, mas também o processamento e a análise dos resultados. Durante os quatro anos desta tese, inúmeros conjuntos de dados foram coletados na linha CPr. Os primeiros experimentos utilizando uma proteína teste (lisozima) foram essenciais para avaliar tanto o método de crio derivatização rápida para a preparação das amostras quanto a qualidade dos conjuntos de dados coletados. Os experimentos iniciais possibilitaram aumentar ainda mais as potencialidades do método de crio derivatização rápida e ajustá-lo às condições da linha de luz CPr. A experiência adquirida com este trabalho inicial foi aplicada, em seguida, na resolução de algumas estruturas inéditas de proteínas de organismos variados. Os resultados permitiram concluir que a aplicação do método de crio derivatização rápida para a preparação dos cristais e o uso de radiação monocromática (1,54 Å), proveniente do síncrotron brasileiro, podem aumentar, significativamente, as chances de sucesso para a determinação de estruturas inéditas de macromoléculas biológicas no país. Apesar de todo o trabalho ter sido realizado com uma fonte de radiação síncrotron (LNLS), os resultados obtidos no final desta pesquisa permitem adiantar e prever o uso de geradores convencionais de raios-X junto com o método de crio derivatização rápida para a resolução de estruturas inéditas em laboratórios de pequeno porte. Isso poderá proporcionar, sem sombra de dúvida, um grande avanço nos projetos pós-genoma em desenvolvimento no país.

Palavras-chave: Cristalografia de Proteínas, Radiação Síncrotron, Método de Crio Derivatização Rápida e Estruturas Macromoleculares Inéditas.


Abstract

Abstract

    Nowadays, three-dimensional models of macromolecules obtained by X-ray diffraction (crystallography) and nuclear magnetic resonance techniques are one of the main bases for rational drug design. The protein crystallography field is responsible for almost 85% of all macromolecule models found in databases. This fact, by itself, is responsible for great progress of the field in research institutions and pharmaceutical industries. From the time when the CPr beamline of the Brazilian National Synchrotron Light Source (LNLS, Campinas, SP, Brazil) was built and its use by the scientific community was authorized in 1997, hundreds of X-ray diffraction datasets have been collected. Most of the datasets collected at the CPr beamline were used to solve the structure of proteins by the molecular replacement method. This method involves the use of a known search model, closely similar to the investigated macromolecule. However, until 1999, when the project for this thesis was written, no more than two novel crystallographic structures had been solved in Brazil. As a result of this, the project had the main goal to optimize the conditions required to the solution of novel macromolecule structures using the CPr beamline at the LNLS. This project involved not only preparation of samples for data acquisition, but also processing and analysis of results. During four years, several X-ray diffraction datasets were collected at the CPr beamline. First experiments using a test protein (lysozyme) were essential to check the quick cryo soaking approach for sample preparation as well as the quality of datasets. These initial experiments allowed to increase the applicability of the quick cryo soaking approach and to adjust it to the CPr beamline. The experience acquired as a result of this initial work was used to solve the structure of a few novel proteins from different organisms. The main conclusion achieved after this work is that the use of the quick cryo soaking approach to prepare crystals for data collection and the use of monochromatic radiation (1,54 Å) from the Brazilian synchrotron can noticeably increase the chances of success in the determination of novel protein structures in our country. Even thought only synchrotron radiation was used in this work, results obtained at the end of this research indicate and forecast the use of conventional X-ray sources with the quick cryo soaking approach to solve the structure of novel proteins in small laboratories. This may promote, with no doubt, great advances in pos-genomic projects under development in our country.

Key words: Protein Crystallography, Synchrotron Radiation, Quick Cryo Soaking Approach and Novel Macromolecule Structures.